本指導原則旨在指導注冊申請人對乙型肝炎病毒耐藥相關的基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。
本指導原則是針對乙型肝炎病毒耐藥相關的基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。
本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準的不斷完善和科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。
適用范圍
（一）臨床背景
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV 感染的流行強度差異很大。全國2006年乙型肝炎血清流行病學調查表明，我國1-59歲一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率為7.18%，2014年中國疾病預防控制中心開展的全國1—29歲人群乙型肝炎血清流行病學調查結果顯示，1—4歲、5—14歲、15—29歲人群HBsAg陽性率分別為0.32%、0.94%和4.38%，我國現(xiàn)有HBV感染者約有8000萬。在臨床治療慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒藥物是最主要的手段。抗HBV藥物主要包括干擾素α和核苷（酸）類似物兩大類，其中核苷（酸）類藥物服用便捷，抗病毒效力強，不良反應較小，但核苷（酸）類藥物在抗HBV治療中需要長期服藥，一旦出現(xiàn)病毒耐藥，可能導致治療失敗、病毒DNA反彈、肝功能惡化甚至肝衰竭。因此，如何發(fā)現(xiàn)病毒耐藥突變，進而合理調整治療方案，在慢性乙型肝炎臨床治療中具有極其重要的意義。
HBV屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因組含有4個部分重疊的開放讀框（ORF），即前-S/S區(qū)、前-C/C 區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。其中P區(qū)編碼聚合酶/逆轉錄酶，目前已知的核苷（酸）類藥物的耐藥突變均發(fā)生在HBV的P區(qū)。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復制需經(jīng)過以前基因組RNA為復制中間體的逆轉錄過程。在此過程中，HBV逆轉錄酶由于缺乏嚴格的校正機制，導致HBV復制過程中核苷酸錯配率較高。HBV復制的這種過程和特點，導致同一患者體內不同的HBV株基因序列之間也存在差異，因此，每一個患者體內的病毒都是由不同基因序列的病毒株組成的動態(tài)變化的病毒準種，不同基因序列的病毒株在病毒準種中所占的相對比例，一方面取決于病毒株自身的復制能力，另一方面也受到機體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇壓力的影響。
抗病毒藥物核苷（酸）類似物進入機體后，形成三磷酸活性成分，與機體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭性結合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA鏈合成終止。如果患者體內的HBV P區(qū)序列發(fā)生突變，導致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結合力降低，突變的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降，在繼續(xù)應用核苷（酸）類似物治療的情況下，突變株病毒由于對核苷（酸）類似物不敏感而逐漸成為優(yōu)勢株，從而導致患者對于核苷（酸）類似物的耐藥。
乙型肝炎病毒的耐藥突變分為原發(fā)性耐藥突變和補償性耐藥突變，原發(fā)性耐藥突變指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發(fā)生突變，導致突變病毒株對治療藥物的敏感性下降。雖然原發(fā)性耐藥突變株對藥物的抵抗性增加，但也常導致突變病毒本身的復制能力下降。補償性耐藥突變指由于原發(fā)性耐藥突變病毒株復制能力下降，在原發(fā)性耐藥突變的基礎上，病毒株在其它位點發(fā)生突變，這些突變可部分恢復突變病毒的復制能力或可導致突變病毒對藥物敏感性的進一步下降。
目前經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準用于抗HBV治療的核苷（酸）類似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、恩替卡韋（ETV）、替比夫定（LdT）、替諾福韋酯（TDF）和富馬酸丙酚替諾福韋（TAF）等。與拉米夫定常見耐藥相關的突變?yōu)?/span>rtM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多與rtL180M聯(lián)合出現(xiàn)，rtM204I可單獨出現(xiàn)。與阿德福韋酯常見耐藥相關的突變?yōu)?/span>rtN236T與rtA181V/T，兩個位點可單獨或聯(lián)合出現(xiàn)。與恩替卡韋常見耐藥相關的突變是在rtM204V+rtL180M基礎上，再聯(lián)合rtT184、rtS202或rtM250三個位點中至少一個位點的氨基酸替代突變。與替比夫定常見耐藥相關的突變?yōu)?/span>rtM204I，其它位點如rtA181V/T等尚存在爭議。替諾福韋酯和富馬酸丙酚替諾福韋目前尚未發(fā)現(xiàn)確認的耐藥突變。
HBV耐藥相關的檢測主要包括基因型耐藥檢測和體外表型分析等。
HBV基因型耐藥檢測是指采用分子生物學方法檢測已在體外表型分析中被證實與抗病毒藥物耐藥相關的HBV突變的臨床檢測。目前已批準產(chǎn)品采用的方法主要包括：PCR-測序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向雜交法（PCR-reverse hybridization assay）、實時熒光PCR法（real-time PCR）等。
HBV體外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公認的確認耐藥的檢測方法，通過體外復制系統(tǒng)證實檢測到的HBV突變會降低其對抗病毒藥物的敏感性，常用半數(shù)有效濃度（50% effective concentration，EC50）或半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）來評價耐藥程度的高低。其方法是將含有待檢測耐藥突變位點的HBV全基因組導入肝細胞來源的細胞系，再將不同濃度梯度的核苷（酸）類似物加入細胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過一定培養(yǎng)時間后檢測藥物作用下HBV DNA的復制情況，計算EC50，通過與野生株病毒的EC50比較，判斷該突變對核苷（酸）類似物的敏感性。當抑制病毒復制所需的EC50與野生株相比增加l00倍以上稱為高度耐藥、l0—99倍為中度耐藥、2—9倍為輕度耐藥。
（二）本指導原則適用范圍
本指導原則所述乙型肝炎病毒耐藥相關的基因突變檢測試劑是指利用分子生物學技術，對人體血清/血漿樣本中乙型肝炎病毒耐藥突變位點進行定性檢測的試劑。臨床適用人群為核苷（酸）類似物治療過程中出現(xiàn)病毒學突破的患者。除非有明確證據(jù)表明初治患者感染HBV來自接受核苷（酸）類似物抗病毒治療患者，一般不主張對初治患者進行基因型耐藥檢測。
本指導原則是基于實時熒光PCR方法對產(chǎn)品相關申報資料提出要求，其他方法學的產(chǎn)品可依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中具體內容是否適用，如不適用，可另行選擇符合自身方法學特性的技術要求或評價方法。
本指導原則適用于進行產(chǎn)品注冊和相關許可事項變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規(guī)要求。
詳細內容，見https://www.cmde.org.cn/CL0112/20613.html